抑制性消减杂交技术(SSH)文库构建服务

时间：2012-05-16作者：上海药巢生物工程有限公司浏览：55

 

抑制性消减杂交技术(SSH)文库构建服务

抑制性消减杂交技术SSH是建立在抑制PCR与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。杂交二级动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。抑制PCR是利用链内退火优于链间退火的特点．使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。差异表达的cDNA(目标)存在于检测子cDNA中而在驱赶子cDNA中缺失或丰度较低。检测子与驱赶子双链cDNA首先用四碱基限制性内切酶消化产生平末端。再把检测子cDNA片断分成两份（1和2）分别与接头1和接头2连接，形成两组检测子，（1）和（2）。SSH技术用了两次杂交，**次中把过量的驱赶子加到每份检测子样品中。然后将样品热变性并退火。检测子单链cDNA片断（a）被均化，即平均高、低丰度的cDNA浓度，使其基本相等。均化的发生是因为据杂交的二级动力学，重退火过程中高丰度分子能更快产生同源杂交cDNA(b)。而且，检测子的单链cDNA(a) 片断中差异表达基因的cDNA被显著富集，而 “共有的”非靶标cDNA与驱赶子形成异源杂交体。  在*二次杂交中，经过**次杂交的两份样品被混合。只有保持均化并消减的检测子cDNA能重新结合形成（b）,(c)和新的（e）杂交体。这一阶段加入的*二部分变性驱赶子进一步定集了差异表达基因的部分（e）。新形成的（e）杂交体具有能区分于**、二次杂交中形成的杂交体（b）和 (c)的重要特征，就是其在5 端有不同的接头序列，一者来自于样品1，一者来自于样品2。这两个序列使得在PCR中用P1和P2这对各自对应于接头1和2外部的引物时，可以**扩增消减和均化的片断（e）。要完成选择性扩增，在PCR进程前需进行一个延伸反应补平这些分子粘性末端，以便于引物退火。 在所有PCR循环中，只有（e）型分子才能被指数级扩增。（b）型分子因含有长反转重复序列末端，而在每次变性－退火PCR步骤后形成稳定的“锅柄样”结构。“锅柄样”结构不能作为指数级PCR的模板，因为长接头序列的分子内退火比短得多的PCR引物与模板间的分子间退火要更**和稳定。这就是抑制性PCR的效应。而且，（a）型和（d）型分子不含引物结合位点，（c）型分子只能以线性速率被扩增。只有（e）型分子在其末端具有不同的接头序列，使其能够在PCR中得到指数级扩增。抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下.首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA 样品反转录为cDNA,把含有目的基因的cDNA 称为测(tester)，把参考cDNA 称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I 切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA 分为两份,每份连接不同的接头,即:接头1(adaptor 1)和接头2 (adaptor 2). 接头为双链DNA 片段，且5’- 端均无基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA 的5’- 末端连接，两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交. **次杂交在每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学*二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集. *二次杂交，将进行过**杂交的两组样品不经变性而直接混合，只有剩下的经过消减并平均化了的差异表达的单链cDNA 可以重新结合为新的杂交体分子，这种杂交体分子两端带有不同的接头1和接头2，加入新鲜变性的驱动进行*二轮消减杂交，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA 酶补平末端，这样差异表达的测试序列- 杂交体分子5'- 和3'- 端就有了进行巢式PCR 所需的不同的退火位点. 最后，进行两次PCR 反应，**次PCR 只有两端连接有不同接头的双链cDNA 片段才得以指数扩增，而其他形式如一端有接头，而另一端无接头的只能线性扩增，没有引物结合点的不能扩增，还有两端为同一接头的形成袢状而无法获得指数扩增. 利用巢式引物进行*二次PCR，富集差异表达的基因片段. PCR 产物可以被直接插入T 载体，或者利用接头1 上的NotI/SmaI/XmaI 位点和接头2R 上的EagI 位点进行定向克隆，或者接头与cDNA 连接处的RsaI 位点平端克隆. 然后利用测序和杂交分析来分析差异表达的序列，或者用PCR 产物作探针来筛选DNA 文库.抑制消减杂交技术的关键:tester与driver要配对密切，较好双方是共源细胞株，这样双方才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系密切，从而减少工作量、减少下一步工作的盲目性.在选用限制内切酶时应尽量选用对于基因组DNA是酶切位点较少的限制内切酶，使酶切后产生的片段尽量大一些。接头要含有酶切位点以连于平端cDNA上，重要的是要在其末端含有一段反向末端重复序列，这使得在PCR反应中能选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA片段的扩增。 一个胚胎细胞分化为不同的组织器官，或者是正常的组织突变为**组织，都可能涉及在同一基因组背景下不同基因的差异性表达。所以寻找差异表达的基因就有可能揭示细胞分化的机制或者**的成因。基于抑制性消减杂交（SSH）的方法构建cDNA文库是近年来发展起来的进行功能基因组学研究，寻找差异基因的一种非常有效的方法，该技术克服了消减杂交技术无法克隆低丰度表达基因的缺陷，并且降低了假阳性率，相对于其它差异显示技术具有很大的优越性。 操作程序 ： 1.由您提供相关背景材料以供参考。 2.签订技术服务合同，商定服务收费、任务期限等。您需要预付实验总费用的80％作为实验预付款。 3.由您提供实验所需的足够量的样品，本公司不接受您提供的RNA样品，除非您有足够的证据证明所提供的RNA没有问题。 4.进行RNA的抽提，抑制性消减杂交按照BD Clontech的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit操作步骤进行。 5.将扩增号的具有差别表达的序列片段克隆到T载体并转化大肠杆菌。 6.随机挑取5个阳性克隆进行PCR验证。 7.提供实验报告及构建于T载体的差异文库（涂布后的平板）。 　 收费标准：35000人民币 实验期限 ：20个工作日


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