不同土壤类型采用何种研磨方案效果较佳

时间：2014-08-21

作者：Suzanne kennedy 来源：美国MoBio实验室

我们在产品研发过程中需要收集大量各种各样的样品，然后找出较佳的微生物DNA提取方法。所以当我们开发PowerLyer的操作流程的时候，希望能找到适合各种样品的一套方法。我们之前在研究均质研磨和研磨珠套管的时候就知道，根据土壤类型不同选择合适的研磨珠可以增加DNA的得率。所以我们决定使用PowerLyzer做一个类似的研究去回答一个问题：在强力珠磨研磨机上使用一样的操作流程对不同类型土壤DNA得率和完整性结果是否一样？很多人通过查阅参考文献找他们一样的土壤类型的提取方法流程，然后毫无优化改变地照搬。可是，一个提取方法能通用于所有类型土壤吗？

在前面的文章《DNA提取 I：土壤的分子生物学特性》，我们对土壤的裂解均质有了全面的了解。今天，我用实例来回答这些问题。我们使用高速研磨机（PowerLyzer）对比了两种不同类型土壤的DNA得率和完整性，其中一个粘土含量高，一个**碳含量高；还加入了两种不同研磨珠：0.1mm玻璃研磨珠（货号13118）和0.7mm石榴石研磨珠（货号13123）。结果很让人惊讶。

研究方法:

我们收到了来自加利福利亚州立大学土壤研究中心的不同类型土壤样品，并选择了粘土含量差不多而**碳含量有差异的两种土壤。其中一种含粘土45%，**碳2.5%；另一种含粘土40%，**碳高达5%。**碳含量越高，生物量越多，意味着较终DNA得率越高。

为了做对比实验，选择了PowerSoil DNA Isolation Kit的0.7mm石榴石研磨珠和PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation kit的0.1mm的玻璃研磨珠。在PowerLyzer上从2000 RPM起到较大转速5000RPM，做系列研磨试验。每个样研磨45s。

PowerSoil试剂盒提取的DNA用Nanodrop分光光度计测量含量，跑电泳检查完整性。把玻璃研磨珠做的结果用蓝色标记，石榴石研磨珠做的结果用红色标记，做成下面的条形图。

结果：

粘土，低**碳含量土壤：

从**个图看得出来，高粘土含量土壤得率更高。我们可以看到玻璃研磨珠在3900-4200RPM的时候可以获得较高DNA得率（条带14、16）。很有趣的是，当研磨速度**过4200RPM时，得率不升反降。证明，对土壤样品研磨过头，反而会导致DNA的损失。就是说，获得较高得率的DNA，有个研磨速度和时间上限。

我们还能看到，在低于3900RPM的时候，研磨珠和石榴石提两种土壤样品的DNA得率都差不多，为什么会出现这种情？

有个理论解释说，土壤中含量两种主要成分：容易被裂解的、很难被裂解的。低速研磨的时候两种研磨珠都轻易磨开容易裂解的成分，而3900rpm的情况下玻璃研磨珠把另一个子集也裂解了。这部分可能是真菌和孢子。

可是，研磨太过的时候前面获得的DNA就会被严重破坏降解，造成后面的低得率。

疏松高**碳含量土壤

*二个图是一个高**碳含量的相似土壤做的一样实验。粘土成分高达40%，虽然没有**个样品45%的粘土含量高却得到不同的结果。

石榴石研磨珠、玻璃研磨珠在开始的时候DNA得率都差不多。但当到了3200-3500RPM以后，石榴石的表现则要好于玻璃研磨珠。可是在电泳上却看到DNA破损相对严重一些。断裂的DNA片段推高了OD值而会被误以为得率升高。所以我们一直建议较好测OD的同时结合跑电泳评估检查DNA。

还有很多原因导致OD值不能完全反映真实DNA得率，请看此文Popular Misconceptions about DNA Isolation and Quantification。

对于这种土壤类型，总的来说DNA得率还算高。使用石榴石研磨珠在一系列速度上都能获得理想的DNA得率，并且在4200RPM达到峰值，往后得率不随速度提高而增加。这些数据证明，速度和时间已经到达极限，不能提取到更多DNA了。

总结：

1- 上述数据告诉我们，土壤类型多样，每种都有自己*特的特性。沙滩砂土样品的提取肯定跟森林土壤不一样，每个粘土样品之间可能会有差异性表现。土壤样品质地的一致性、生物丰度不同、**物含量不一等都会影响到较终你能获得多少DNA和选择的研磨方法。

2- 跑电泳结合测OD是较重要较常用的土壤DNA评估方法。使用PowerSoil DNA Isolation Kit提取土壤样品，只会提取出来DNA，不带任何RNA。市面上其它方法会连同RNA一起提取出总核酸，大大推高OD值，错误地以为提取过程很成功。可以通过跑电泳检测DNA的完整性，从而知道研磨力度不够还是有点过了。

3- 因为每个土壤类型都不一样，有必要通过一系列不同速度、研磨时间，甚至采用不同类型研磨珠来做预实验。PowerSoil Kit我们建议从4000RPM 45s开始，因为这个速度和时间对于采用两种不同研磨珠和大多数土壤类型样品来说是较合适的。不过也许你想把速度调低或调高，取决于样品中孢子含量和微生物丰度。尝试不同速度做一系列实验就能知道，你的样品在哪个速度能获得较多高质量DNA。

加利福利亚州立大学的Chris Kitts lab与我们共同参与了此项研究。该校学生完成了五个不同类型土壤分别用Vortex与PowerLyzer，石榴石研磨珠与玻璃研磨珠提取的DNA的t-RFLP分析。点击查看相关海报。

最后，还是建议在启动一个新的项目之前，用你的研磨机做一个线性速度研究。看看之前做土壤使用的实验方案是否合适，对新样品是否需要进一步优化。不同土壤特性*一**，前期多花点时间**后面获得宝贵数据是值得的。

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