为什么说从粪便样品中提取DNA非常类似于提土壤

时间：2014-08-21

作者：Suzanne kennedy 来源：美国MoBio实验室【字号：大中小】

我们收到了许多研究者关于提取粪便样品（fecal sample）DNA的咨询电话。在此，提供一些关于粪便（stool）DNA提取的小建议。

粪便含有种类较其丰富的微生物群体，而每个人肠道内菌群又不一样。粪便菌群的不同影响因素有很多。其中饮食结构对粪便的成分和性状影响较大。素食者粪便中含有大量多糖、植物纤维，因此抑制因子也较多。使用抗生素干扰了肠道菌群的生存，改变了样品中细菌的含量和分布。同样，寿司等生冷食物也会对肠道微生物造成冲击。

粪便样品跟土壤比较类似，包含的微生物种类跟采样地点有关。同样的含有大量各种抑制因子。不同的样品性状还影响后续处理方法。它们更多共通点在于，如果你处理的是表土，样品中会混杂一些土栖蠕虫、鸟的排泄物，或者其它小型动物。这就是为什么MoBio的土壤DNA提取试剂盒也同样适合于粪便样品。

根据样品类型不同，MoBio有好几个试剂盒适合处理粪便类物质。粪便DNA提取（UltraClean Fecal DNA Kit）适合于抑制因子不多的样品。强力土壤DNA提取（PowerSoil Kit）是处理含大量的PCR抑制因子样品的可以选择。同时，它也是人类肠道微生物基因组研究计划推荐处理办法。不过有几个步骤需要做改动。

操作说明书：

人体肠道微生物基因组研究计划已经在其网站底部"Metagenomic WGS"部分公布了一套核酸提取标准操作步骤。

打开操作说明书*65页，描述了强力土壤DNA提取试剂盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）的实验操作。

该操作说明书里头，HMP研究者把搜集的2ml样品加入到50ml Tube管中，并加入5ml研磨缓冲液[Bead Solution（cat# 12988-10-BS）]，然后分装。

如果手上只有一个样品需要处理。建议直接把粪便样品加入到PowerSoil Kit的厚壁研磨管中（PowerBead tube），涡旋振荡30~40s混匀样品。

下一步加热，以加强对微生物细胞裂解。

65℃加热10分钟，然后95℃加热10分钟。

加热处理后，接着按照强力土壤DNA提取试剂盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）标准实验步骤进行。其中只需要在*12步稍作改动。即加入C3后离心时间由1分钟增加到2分钟。

DNA较终体积为100ul，可以不经处理进行基因测序。

粪便样品状态更接近于粘土，因此使用PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit可能会取得更好的提取效果。较近MoBio在研究使用玻璃研磨珠对提取粘土DNA得率进行改进。有了结果以后将**时间公布结果。

工作原理：

有个理论可以解释，为什么强力土壤DNA提取（PowerSoil）和粪便DNA提取（UltraClean Fecal）提取粪便样品效果如此的好（抛开IRT除抑制因子步骤不说），使得较终得到的DNA绝大部分为微生物DNA。研磨珠击打阶段前，人类细胞已经在上述加热步骤被裂解了。而微生物细胞需要研磨珠击打破碎。游离的人类DNA在研磨珠击打步骤被迅速切开降解，微生物DNA依然保持大分子结构。

试剂盒中DNA吸附绑定阶段，使用的C4结合溶液（binding solution）只会捕捉大分子的DNA。RNA和小片段破碎DNA将在清洗阶段被除去。这意味着进入下一步实验的较终DNA中绝大部分为微生物DNA。在进行基因测序的时候，检测到的信息主要就是关于肠道微生物的了。

粪便RNA

想提取粪便样品中的RNA，请使用PowerMicrobiome?粪便RNA提取试剂盒（PowerMicrobiome? Fecal RNA Isolation Kit）（请参看下文参考文献）。该试剂盒一次可从大体积样品中提取得到更多总RNA。如果你希望提取小量粪便样品，请与我们联系（anbiosci@）。

人类肠道微生物相关文献：

· Dominguez-Bello, M.G., E.K. Costello, M. Contreras, M. Magris, G. Hidalgo, N. Fierer, R. Knight. In Press. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the founder microbiota across multiple body habitats in newborns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Jun 2010; 10.1073/pnas.1002601107.

· Fierer, N., C.L. Lauber, N. Zhou, D. McDonald, E.K. Costello, R. Knight. 2010. Forensic identification using skin bacterial communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 6477-6481.

· Costello, E.K., C.L. Lauber, M. Hamady, N. Fierer, J.I. Gordon, R. Knight. 2009. Bacterial variation in human body habitats across space and time. Science. 326: 1694-1697

RNA PowerSoil Kit 提取粪便样品

· Exfoliated Cells in Stool: A Source for Reverse Transcription-PCR–Based Analysis of Biomarkers of Gastrointestinal CancerYing Jie Yu, Adhip P.N. Majumdar, Jordan M. Nechvatal, Jeffrey L. Ram, Marc D. Basson, Lance K. Heilbrun, and Ikuko Kato. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.,Feb 2008; 17: 455 – 458.

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