科研小技巧：机智地保护珍贵的RNA

时间：2020-01-05

作者：Suzanne 来源：美国MoBio实验室【字号：大中小】

首先，无论RNA来源哪里，神经都必须绷紧，尤其是数量有限或非常珍贵的样本。因为RNA非常不稳定，操作时动作要快，心要细。其实有好多方法可以在操作过程中保护你的RNA，让你不至于那么焦虑。本篇将教你如何克服困难，更快更聪明地完成RNA提取。

1、化学保护

RNA的保护从第一步样品的研磨开始。你可能已经注意到很多提取说明书都要求添加β巯基到裂解缓冲液。β巯基是种能不可逆地变性RNase还原剂，。所以当它的难闻怪味拒推销人员于实验室门外时，你却没办法拒绝它，尤其是组织培养细胞。组织样品中含有大量高活性的RNase，所以较好加上β巯基吧。

如果提取过程中用到了，那么它能很好地替代β巯基灭活核酸酶。

2、快速样品均质化！

下一步就是把含BME的裂解缓冲液（或基于的裂解试剂）与样品混匀然后研磨。前面的文章我们讨论过了样品裂解均质化的问题，也对不同样品使用什么样的研磨珠套管有了充分了解。珠磨研磨能在同一条件下一次性均质化整批样品，避免处理方法带来的样品间人为差异。

为了保护你的RNA，切记快速做好这一重要步骤。当组织从冰箱拿出来，**时间放入研磨管或其它容器中。此时组织开始化冻，RNase活性复苏也开始计时。

把组织样品从冰箱取出组织样品前，就要准备好带裂解缓冲液的研磨管，把它们放到Stratacooler或类似的冷冻模块上，靠着刻度条摆放，保持Tube管处于较冷的温度。裂解缓冲液中含有较高浓度的氰酸胍盐，在低温的时候会沉淀。当样品开始珠磨研磨时，产生的热量会迅速溶解盐溶液。较低温度的Bead Tubes，可让RNA的较大程度保持完整性。

组织样品一般以50mg分块，用RNALater冷冻保存。通常每次提取我会加样25mg，也就是说每次化冻一块组织就能做两次提取。一管样品麻利地一切为二，放入已经预冷的研磨管。即样品从冰箱到天平然后快速转移到-20℃预冷研磨管。当所有样品都灌入研磨管，再一起放上PowerLyzer上45℃两个循环均质。所有被冻上的盐会马上溶解。

快速研磨是为了让所有细胞迅速暴露在裂解缓冲液和BME中，这一步很重要。如果裂解混合液中含有小块细胞团，无论多小，仍带活性的RNase会降低RIN值，电泳凝胶上也能看到降解的RNA。彻底的均质化非常重要。

手提式的搅拌机也可以用来提取RNA，尤其适用于大提。30s就能打碎组织样品。但是你一次只能弄一个样品，其它所有的样品就必须静坐着等待。可以保持裂解缓冲液低温，切忌研磨前不要冷冻。

3、DNA去除

剩下的步骤相对简单，如果起始样品的质量就很好，此时洗脱下来的RNA也是质量很高的。那还有什么会引起RNA的降解或损失呢？对的，DNase消化步骤。

DNase通常就在离心柱上完成，省去了事后处理的麻烦。但是，有些样品含有太多的DNA（如脾、胸腺，甚至某些土壤），使得On-Column DNase并不都能非常有效地完全去除DNA。在这种情况下，对较终溶液进行DNase消化就很有必要。

室温稳定保存的DNase和DNase去除树脂

常规方法最后需要用EDTA和加热来灭活DNase。但是他们都会影响RT-PCR。EDTA抑制RT-PCR酶反应，加热RNA会降低其完整性。而且绝大多数DNase都需要冷冻保存，事先分装减少反复冻融引起酶活性下降。

我们自始至终都在建议整套系统来保护RNA。RTS DNase是个活性非常高的常温保存液体DNase（1μl酶20min内能消化30μg DNA）。较赞的是DNase消化完成后的收尾步骤。RTS DNase还带有DNase去除树脂，它能吸附绑定DNase和阳离子与RNA样品分离，使得不用添加带抑制性的物质或加热就能直接用于qRT-PCR。此树脂效率很高，对反应液中10 units的酶处理效果（下图条带3-4）比另一种常用树脂处理2 units的酶效果要好很多（条带1-2）。

这意味着你能尽可能地保护好经过数小时努力提取到的珍贵RNA，基因表达分析也能更准确。

RTS DNase去除树脂完全去除DNase。使用RTS DNase? kit和竞争对手的试剂盒消化样品并去除DNase，然后用MOBIO的DNase-free认证方法检测残余DNase活性。条带5为阴性对照，不添加DNase。样品37℃孵育1h，65℃灭活5min。较终结果1%凝胶电泳展示。RTS DNase去除树脂成功去除所有DNase（条带3-4），而竞争对手的树脂则失败（条带1-2）。

总结

当你了解哪里地方容易引起问题，RNA提取就变得容易多了。在加了保护剂的裂解缓冲液中快速研磨样品是关键，然后轻柔地用DNase消化就更加简单。

是的，你还需要使用经过检测认证的RNase-free的手套、实验室清洁剂去去除工作台和实验设备上所有的核酸酶。在我们的实验室里，这些都是较常规基础的事情。基本要素还包括RNA制备过程中使用的每种化学试剂、塑料制品和研磨珠。使用无论提取什么样品的RNA，β巯基，快速的研磨，RNase-Free DNase消化与DNase去除树脂都是你成功的每一环。

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