科研小技巧：分光光度法与荧光染色法在定量检测DNA应用中的区别

时间：2014-12-19

	作者：Suzanne  来源：美国MoBio实验室【字号：大 中 小】


	
		今天我准备讨论一种可能在你整个科研生涯中一直**的常规方法。它是如此的基本、简单，你可能根本没在意。但我希望你在睡觉前能稍微想它一下。我要说的是什么？当然是质粒提取。
	
	
		质粒DNA提取作为实验室常规实验，你肯定很希望就算提取过程出错了，依然能回收到DNA。但是，你回收到的真的仅仅是DNA吗？事实上质粒提取是对两种定量检测DNA方法较有效的验证：分光光度法 VS. 荧光染色法（Picogreen）。
	
	
		像大多数实验室一样，我们也用分光光度法定量检测核酸。分光光度法简单、灵敏，*标准曲线。但是，当我们用分光光度法和Picogreen法定量检测我们的质粒提取试剂盒与其它品牌质粒提取的质粒时，结果令人吃惊。再深入探讨前，我们需要了解…
	
	
		质粒DNA提取作为现在较常规的实验，你可能希望就算提取过程中尽管犯了点小错，DNA还是能要回来。但是，你要回来的真的只有DNA吗？碰巧的是，质粒提取是区分两种DNA定量检测方法之间区别的较好范例：分光光度法 VS. 荧光染色法（Picogreen）。
	
	
		在我们实验室，我们也用分光光度法定量检测核酸。它简单、灵敏且不需要标准曲线。但是，当我们用分光光度法和Picogreen法比较提取的质粒的定量检测结果时，对于我们的质粒提取试剂盒和竞争对手的盒子，结果非常惊讶。在我们做进一步分析前先了解一下Picogreen。
	
	
		什么是Picogreen？
	
	
		Picogreen是一种荧光染料，与双链DNA特异结合后，能在485/530nm波段发出荧光。可用荧光分析仪或Qubit定量检测样品中的DNA含量。常用的分光光度法检测260nm（A260）处的吸光值，缺点是光不能区分DNA和RNA、盐、染色剂等杂质 是获知含RNA的DNA样品准确浓度的非常有用的工具。
	
	
		跟质粒制备有什么关系？
	
	
		还记得你加入到Tris重悬浮液的RNase吗？它是用于消化为制备质粒而培养的健康的处于对数生长期的大肠杆菌中大量存在的RNA。然后，理想情况下，消化了的RNA从硅胶离心柱上洗掉，你只获得高纯度DNA。
	
	
		让我们吃惊的是质粒DNA中有大量RNA污染。见下面的例子。使用琼脂糖凝胶电泳，电泳中清晰看到RNA杂质的模糊条带。
	
 
	
		*竞争品牌试剂盒需要需要在提取前往重悬缓冲液加入RNase A，MOBIO的试剂盒不需要
	
	
		但是，分光光度计中RNA杂质并不能像picrogreen那样清楚显示。
	
 
	
		如果你只用分光光度计检测DNA，以及竞争对手的试剂盒，你肯定会觉得前面的试剂盒更好。凝胶上显示他们得率是差不多的，但是分光光度计读数让你认为有双倍的DNA。
	
	
		但是，picogreen却给出了不一样的结果。当有RNA存在的时候，原来2-3倍的假得率显现了真实得率。使用MOBIO试剂盒，分光光度法得到的结果更接近实际得率。
	
	
		有何意义？
	
	
		这意味着当你酶消化样品准备做克隆或寄送质粒用于测序前，你能准确地知道实际上有多少DNA。在对克隆结果排疑或者准确计算质粒插入率都有很大帮助。
	
	
		我知道并不是每个人都能用Picogreen检测他们的DNA。而且并不都一定要知道准确的DNA量。我们也不常用这个方法，说实在的。只是请注意，当你看到质粒DNA凝胶底部有个模糊的条带，你的质粒得率可能只有测量值的一半，做好相应的计划准备即可。或者试用MOBIO的Plasmid DNA kit，你就是再也不用担心了。
	
	
		我们也知道同样的问题也会存在于基因组DNA的制备。我们的的建议是什么？至少用两种方法检验DNA质量：琼脂凝胶和分光光度法或picogreen。事实上只用一种办法很难给你足够信息确保下游实验能是否成功进行。

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