青海无菌医疗器械厂房检测出具CMA报告

时间：2023-01-03

作者：山东中安生物安全检测有限公司

PCR实验室是指能在短时间内扩增出目的基因片段的生物工程技术，应用于病毒检测、病原体快速鉴定、个体识别、遗传诊断及基因等领域。

在此次中， PCR实验室主要应用的技术包括：病毒全基因组扩增与测序、核酸杂交技术与荧光原位杂交技术等。

下面是关于 PCR实验室检测的相关内容，希望能对您有所帮助。

PCR实验室检测可分为：样本前处理和样本后处理两个部分：

本文主要介绍样本前处理中的 PCR实验室检测，如有需要也可查看参考文献或咨询相关专业人士。

由于试剂盒等不能保证完全覆盖实验结果，我们需要根据实际情况做一些针对性处理，如：核酸扩增的条件是否合适、实验试剂对实验结果影响程度、实验室人员技术水平以及实验室空间等因素都会影响实验结果。

一、PCR扩增条件

1.水： PCR扩增的过程中，由于核酸浓度高，需要大量清水，一般采用无菌水进行稀释到10-50 mg/mL范围内；

2.电泳主要是通过施加电压让 DNA聚合酶与模板进行化学结合，在一定时间内将模板复制出来；

3.引物的种类、浓度以及长度对 PCR结果有很大影响；

4.模板： PCR扩增反应的结果受模板的影响比较大，因此 PCR实验室应建立自己的模板库。

5. Taq酶：如果实验用 Taq酶进行扩增，需根据 DNA反应体系选择适当的 Taq酶；

6.扩增产物的分析： PCR实验室扩增产物可通过质谱检测（LC-MS/MS）。

二、试剂的选择

实验中常用的试剂有： DNA凝胶电泳试剂（如： PAGE、SDS-PAGE、 SV或SPE-PCR等）和荧光定量 PCR试剂（如 MassA等）。

DNA凝胶电泳和荧光定量 PCR所用探针的选择与其扩增效率相关，一般需根据实验目的来选择探针。

如果实验需要比较高浓度的引物，应选择非特探针（如： MassA）；如果实验是需要检测低浓度（例如1μg/μl、5μg/μl）的目标，则可选择特探针。

荧光定量 PCR的常用探针有：引物和探针类型是影响检测结果的重要因素之一。

不同的检测方法对于每个步骤都有特殊要求，选择适当类型的引物和正确使用适宜浓度的探针对提高检测结果是至关重要的。

由于不同种类引物可能造成相同区域重复扩增，因此应尽可能用相同引物和相应区域引物；在相同 PCR反应条件下，选择更合适、更稳定且易于保存和使用的引物会得到扩增效果；在相同 PCR条件下，也可以选择更稳定且容易获得扩增产物的引物-金标准探针，但应注意该引物并不能保证一定在扩增反应中得到结果。

三、检测试剂盒对实验结果的影响程度

首先要明确检测试剂盒对实验结果的影响，一般情况下：

如果实验需要，则需要先用试剂盒进行确认。

在实验过程中，由于使用的试剂较多，可能会出现假阴性情况（即未扩增出核酸）。

由于 PCR检测的灵敏度和特都很高，对于假阳性结果应立即做其他检查。如果是特殊情况，如：临床样本检测不到核酸时，可以先使用试剂盒进行确认。

最后一个问题：实验室空间的问题。

四、检测样品的保存条件

PCR扩增所需的较适温度为37℃，在低温下，扩增效率会明显降低。

此外还需要注意的是：温度越高，扩增效率越低。

PCR扩增反应需要2-4℃或4-8℃的相对低温环境中进行，所以 PCR检测室要保证环境温度在15-30℃。

由于实验所用液体一般都是有一定粘度和流动性的样品，为了避免核酸变性、减少样品变性、降低试剂成本等原因，需要对核酸进行保护（加入 DMSO）以及对核酸进行预变性以减少变性后引起的假阳性结果。

1、 DMSO是将反应体系中加入质量分数为0.1%浓度的 DMSO作为保护剂，其可防止 DNA及 RNA在反应中变性和降解；

2、预变性是指将反应体系中的样品进行适当缓冲溶液处理以防止样品变性，从而提高 PCR扩增效率。预变性步骤一般可在2-8℃进行。

五、试剂、样本前处理与后处理

常用的试剂包括：

DNA/RNA （通用试剂）：常用的 DNA扩增试剂，例如 Taq酶酶切探针、 dNTP裂解探针等。

酶：酶法 PCR的扩增效率取决于所用的酶种类及浓度，因此在扩增过程中可能需要更换不同的酶。

其他试剂：常规 PCR使用的核酸提取、检测所需引物，引物及探针等均需要进行制备与优化； PCR所需核酸片段（探针），如 DNA片段、DNA-RNA等也需要进行后处理，以保证在 PCR扩增过程中能够达到要求。

常见实验样品有血细胞（血小板等）、脑脊液（细胞和组织）、血清（白蛋白等）及各种生物组织（肌肉和结缔组织等）。

常见实验项目有血清分析：血清蛋白定量检测、抗体定量检测和全血分析；细胞分析：组织活检和细胞学检验；生物样本：基因芯片研究与分析。

六、核酸提取方法与步骤（包括但不限于提取 DNA等）

提取核酸需要先将基因组 DNA溶解，然后再进行下一步处理。

目前常用的方法有以下几种：

1、核酸酶法：利用特酶切反应，将核酸直接从 DNA模板上切割下来，得到目标产物。常见的有 Taq酶、 DNA聚合酶、 RNase。

2、核酸杂交法：利用特杂交反应，将目的基因转化到靶基因的表达上去；

3、原位杂交法：利用组织、细胞或其他微生物的 DNA作为探针，在靶细胞内进行原位检测；

4、毛细管电泳法：利用毛细管电泳和核酸扩增反应相结合，对靶组织和细胞进行标记。

以上都是针对传统方法存在的问题， PCR实验室检测可以根据实际情况使用相应的方法，提高检测结果的准确性。

七、检测仪器与设备

PCR检测仪器与设备主要有以下几种：

全自动恒温扩增仪：

实时荧光定量 PCR仪：

荧光分光光度计：

电子扩增仪或毛细管电泳式自动进样器，具有扩增效率高、反应时间短和检测范围广等优点。

液相色谱仪：

液相色谱是一种专门用于分离提纯和质量控制的小型分析仪器，具有检测灵敏度高、线性范围宽、稳定性好等优点。

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