如何防止PCR实验室污染？

时间：2017-07-18

一、PCR实验室污染主要是下面四个方面
       1、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。   
      2、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。   
      3、PCR扩增产物污染：这是PCR反应中较主要较常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远**PCR检测数个拷贝的极限，所以较微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。   
      4、还有一种容易忽视，较可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。   
      5、实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。  
二、污染的监测   
      一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。    
1、对照试验   
      1）阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。   
     2）阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。   
     3）重复性试验   
     4）选择不同区域的引物进行PCR扩增     
三、防止污染的方法   
     试验人员在PCR操作时，注意遵守PCR操作规范，降低污染的出现。
1、划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现*闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：   
       1）试剂准备区。   
       2）标本制备区。   
       3）PCR扩增区及分析区。   
各工作区要有一定的隔离，操作器材**，要有一定的方向性。如：试剂准备→标准制备→PCR扩增区及分析区。   
切记：任何一间的产物及器材不要拿到其他两个工作区。   
2 . 分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的**净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：   
        1）PCR用水应为高压的双蒸水；   
        2）引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；   
        3）引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。    
3 . 实验操作注意事项   
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：   
      1）戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；   
      2）使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；   
      3）避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；   
      4）操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的**度；   
      5）最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；   
      6）操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的**性，又可以协助判断扩增系统的可信性；   
      7）尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器较容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，较好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该**，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；   
      8）重复实验，验证结果，慎下结论。

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