恒温恒温培养箱对微生物进行五项检测检验

时间：2023-09-19

为加强对化妆品安全性和功效性的管理，国家食品药品监督管理局要求化妆品生产企业在产品上市前需对化妆品功效宣称及安全性进行评价，评价合格的产品方可上市销售。

化妆品是指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。可分为普通化妆品(又称非特殊化妆品）和特殊类化妆品。

根据《化妆品安全技术规范》2015版规定，微生物常规五项检测检验有菌落总数检验、耐热大肠杆菌检验、铜绿假单胞菌检验、金黄色葡萄球菌检验、霉菌和酵母菌检验。

一、菌落总数检验

菌落总数，是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性和兼性厌氧菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。

操作步骤如下：

1. 用灭菌吸管吸取 1：10 稀释的检液 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。另取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成 1:100 检液。吸取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成 1:1000，1:10000，……等，每个稀释度应换 1 支吸管。

2. 将融化并冷至 45℃—50℃的卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃恒温恒湿培养箱内培养 48h±2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约 15mL 卵磷脂吐温 80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置 36℃±1℃恒温恒湿培养箱内培养 48h±2h，为空白对照。

3. 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每 100mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5%的 TTC 溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。

菌落计数方法

先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用 5 倍—10 倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以 2，以代表全皿菌落数。

二、菌落计数及报告方法

1. 首先选取平均菌落数在 30—300 之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数报告之（见表 1 中例 1）。

2. 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30—300之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于 2，应报告其平均数，若大于 2 则以其中稀释度较低的平皿的菌落数报告之（见表 1 中例 2 及例 3）。

3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度较高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度较低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

5. 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30—300 之间，其中一个稀释度大于 300，而相邻的另一稀释度小于 30 时，则以接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

6. 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每 g 或每 mL 小于 10CFU。

7. 菌落计数的报告，菌落数在 10 以内时，按实有数值报告之，大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用 10 的指数来表示。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。

三、耐热大肠菌群检验

耐热大肠杆菌群系需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在 44.5℃培养 24h—48h 能发酵乳糖产酸并产气。该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价化妆品的卫生质量, 推断化妆品中有否污染肠道致病菌的可能。

操作步骤如下：

1. 取 10mL 1：10 稀释的检液，加到 10mL 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置 44.5℃±0.5℃恒温恒湿培养箱中培养 24h，如既不产酸也不产气，继续培养至 48h，如仍既不产酸也不产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。

2. 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h—24h。同时取该培养液 1—2 滴接种到蛋白胨水中，置 44.5℃±0.5℃培养 24h±2h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。

3. 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。

4. 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约 0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。

检验结果报告

根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。

四、铜绿假单胞菌检验

铜绿假单胞菌群属单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在 42℃±1℃条件下能生长。

操作步骤如下：

1.增菌培养：取 1:10 样品稀释液 10mL 加到 90mL SCDLP 液体培养基中，置 36℃±1℃培养 18h—24h。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。

2.分离培养：从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷**基溴化铵琼脂平板上，置 36℃±1℃培养 18h—24h。凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。在缺乏十六烷**基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置 36℃±1℃培养 24h±2h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基呈红色，其他菌不生长。

3.染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。

4.氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片置于灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基对苯二胺试液，在15s—30s 之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。

5.绿脓菌素试验：取可疑菌落 2 个—3 个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置 36℃±1℃培养 24h±2h，加入氯仿 3mL—5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入 1mol/L 的盐酸 1mL 左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。

6.硝酸盐还原产气试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置 36℃±1℃恒温恒湿培养箱培养 24h±2h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。

7.明胶液化试验：取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36℃±1℃恒温恒湿培养箱培养 24h±2h，取出放置于 4℃±2℃冰箱 10min—30min，如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。

8.42℃生长试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置于 42℃±1℃恒温恒湿培养箱中，培养 24h—48h，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。

检验结果报告

被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和 42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。

五、金黄色葡萄球菌检验

金黄色葡萄球菌群为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。

操作步骤如下：

1.增菌：取 1:10 稀释的样品 10mL 接种到 90mL SCDLP 液体培养基中，置 36℃±1℃培养箱，培养 24h±2h。

注：如无此培养基也可用 7.5%氯化钠肉汤。

2.分离：自上述增菌培养液中，取 1—2 接种环，划线接种在 Baird Parker 平板培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置 36℃±1℃培养 48h。在血琼脂平板上菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在 Baird Parker 平板培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置 36℃±1℃培养 24h±2h。

3.染色镜检：挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为 0.5μm—1μm。

4.甘露醇发酵试验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入高度为 2mm—3mm 的灭菌液体石蜡，置 36℃±1℃培养 24h±2h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。

5.血浆凝固酶试验：吸取1:4新鲜血浆0.5mL，置于灭菌小试管中，加入待检菌24h±2h肉汤培养物0.5mL。混匀，置36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，6h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL，分别加入无菌1:4血浆0.5mL，混匀，作为对照检验结果报告

凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。

六、霉菌和酵母菌检验

化妆品检样在一定条件下培养后，1g 或 1mL 化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置 28℃±2℃恒温恒湿培养箱培养 5d，计算所生长的霉菌和酵母菌数，操作步骤如下；

1.样品稀。用灭菌吸管吸取 1：10 稀释的检液 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。另取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成 1:100 检液。吸取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成 1:1000，1:10000，……等，每个稀释度应换 1 支吸管。

2.取 1:10、1:100、1:1000 的检液各 1mL 分别注入灭菌平皿内，每个稀释度各用 2 个平皿，注入融化并冷至 45℃±1℃左右的虎红培养基，充分摇匀。凝固后，翻转平板，置 28℃±2℃培养 5d，观察并记录。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约 15mL 虎红培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置 28℃±2℃恒温恒湿培养箱内培养 5d，为空白对照。

3.计算方法：先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，应选取菌落数在 5 个—50 个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每 g（或每 mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数。其他范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之。

4.每 g（或每 mL）化妆品含霉菌和酵母菌数以 CFU/g（mL）表示。

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