酶的制备一般包括三个基本步骤,即提取、纯化和结晶。首先将所需要的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地要夹带着一些杂质,而后再将酶从溶液中选择地分离出来,或者从酶溶液中选择地除去杂质,最后制成纯净的酶制剂。接下来德晟详细解读一下酶制剂的提取过程。
1)酶制剂的提取之-细胞破碎
化学法:用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和等可使细胞破碎、颗粒体结构解体,从而把酶释放出来。例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2~3次,制成丙酮粉供多种酶的提取用;用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”,使两者形成复合物,并带上静电荷,由于电荷之间的排斥作用,使膜破裂,达到溶解。
酶解法:用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构,然后再进行提取。但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的,如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的,若用自溶法提取,酶原已转成酶,纯化就很困难。而用纯的工具酶降解法是无此缺点,但成本较高。
2)酶的提取之-酶液的浓缩
用葡聚糖凝胶(分子筛)浓缩:取相当于酶液量1/5的干葡聚糖凝胶G15或G25,分次加入酶液中,搅拌30min,使凝胶吸水膨胀,进行吸滤。经重复数次操作即可在短时间内把酶液浓缩至所需的体积。也可将酶液装于透析袋内,埋入干凝胶中,袋内酶液也可得到浓缩。
用超滤法浓缩:超滤技术在其可筛分范围内分离酶分子时不发生“相态”变化,可以避免酶蛋白变性,且分离度快,所以愈来愈被广泛采用。各种不同孔径的超滤膜,适用于实验室规模及一定工业规模的酶液浓缩。如国产二纤维素制成10~200埃孔径的超滤膜,用于实验室规模固氮酶液的脱盐和浓缩,效果良好。
3>酶的提取之杂质的去除
酶提取液中常含有杂蛋白、多糖、脂类及核酸等杂质,可用下述方法去除:
调PH和加热法:利用蛋白质对酸、碱和热变性方面性质的差异,可去除非活性杂蛋白。如制备脂肪酶时,在pH3、4时以400C温度加热150 min,淀粉酶活力可丧失90%而被除去,而脂肪酶活力仍保持80%以上。
蛋白质表面变性法:蛋白质表面变性后其性质有所不同,借以去除杂蛋白。如制备酶时,加入和进行振荡可以将杂蛋白变性而去除。。
加保护剂热变性法:酶与底物或竞争性抑制剂结合后,其稳定性常显著增加。所以常用它们为保护剂,再用一些剧烈手段破坏杂蛋白,如用D-为D-氨基酸氧化酶的保护剂,经加热除去杂蛋白,使该酶得到很好的提纯。
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