百萤课堂之Helixyte? iFluor 750 核酸标记染料实验方案

时间：2024-01-30

Helixyte™ iFluor 750 核酸标记染料是我们 Helixyte 核酸标记和缀合技术的关键成员之一。由于核酸分子中缺乏反应性部分，标签/半抗原与核酸的标记/缀合一直非常具有挑战性。胸腺嘧啶和鸟苷经常被探索用于核酸缀合，例如光交联（通过补骨脂素与胸腺嘧啶）或鸟苷的化/尤氏标记。然而，这些现有的缀合要么繁琐，要么需要严格的条件且产量低，因此不适合常规实验室使用。在类似条件下，我们的 Helixyte 核酸标记和缀合技术易于使用，产量高。 Helixyte™ iFluor 750 核酸标记染料提供了一种特的方法，通过简单的混合步骤将 iFluor 750 荧光团附着到核酸上。标记试剂很容易与鸟呤的N7反应形成稳定的共价键。贴标过程简单、快速、产量高。标记的核酸与未反应的染料的分离可以通过简单的乙醇沉淀、旋转柱或透析来完成。由此产生的标记 DNA/RNA 探针具有明亮的蓝色荧光，可以使用 AMCA/Alexa Fluor 750 滤光片组轻松检测到。它们可用于斑点、Northern 和 Southern 印迹、RNA 和 DNA 原位杂交、多色荧光原位杂交 (mFISH)、比较基因组杂交 (CGH) 或微阵列分析等。

实验方案

样品分析方案

概述

将 DNA 与 Helixyte™ iFluor 750 核酸标记染料储备溶液混合

37°C 孵育 1 小时

根据下游应用的需要进行纯化。

溶液配制

除非另有说明，所有未使用的储备溶液应分成一次性等份，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环

打开小瓶之前，请在室温下解冻 Helixyte™ iFluor 核酸标记染料。短暂离心以收集干燥的沉淀

制备 Helixyte™ iFluor 核酸染料储备溶液

1.将 110 μL DMSO 添加到 Helixyte™ iFluor 750 核酸标记染料小瓶中，制备 10 mM 储备溶液。

注意：建议将任何未使用的储备溶液分成一次性等份。将等分试样储存在 ≤-20 ℃ 下并避光。避免反复冻融循环。

操作步骤

1.根据下表1中的信息准备标记反应。

表 1. 标准核酸标记反应。

组分	添加到反应中的体积	终浓度
DNA (1 mg/mL)	2 to 5 µL	2 to 5 µg
Helixyte™ iFluor 750 核酸标记染料储备液	0.5 µL	50 µM
TE 缓冲液（pH 8 至 8.5）	添加足够的缓冲液以将体积调整至 100 µL

注意：此 DNA:染料比例可产生适合大多数应用的标记效率。可根据应用要求调整 Helixyte™ iFluor 750 核酸标记染料的量或反应孵育时间，以修改标记密度。优化 DNA 与染料的比例以获得高的标记率

2.避光、37℃孵育反应1小时。

注意：孵育 30 分钟后，短暂离心反应，以尽量减少蒸发的影响并保持反应组分适当的浓度。

注意：或者，反应可以在室温下孵育 2 小时。为了获得的标记条件，我们建议在 37℃ 下孵育。

3.孵育后，可以纯化标记混合物以去除任何游离的标记染料。有关说明，请参阅下面的“用酒精沉淀纯化标签混合物”部分

用酒精沉淀纯化标签混合物

1.将 0.1 体积 (10 uL) 5M 氯化钠和 2 - 2.5 体积冰冷的 ** 乙醇 (250 uL) 添加到反应中。充分混合并在 ≤ -20°C 下放置至少 30 分钟。

2.在冷冻微量离心机中全速 (>14,000 x g) 离心 15-30 分钟，沉淀标记的核酸。沉淀后，用微量移液器小心地除去乙醇。不要打扰颗粒。

注意：少量核酸可能难以看到。在微量离心机中标记并定向含有沉淀物的管，以便沉淀将在预定位置形成。

3.用 500 μL 室温 70% 乙醇清洗沉淀一次。再全速离心 15-30 分钟。

4.用微量移液器除去所有乙醇痕迹。不要让样品干燥过 5 分钟，因为沉淀可能会变得难以重新悬浮。

5.用约 30 µL 无菌水重悬标记的 DNA。

6.储存纯化的、标记的核酸以供长期保存或置于冰上以便立即使用。

词条
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