游离DNA提取方法

时间：2022-04-10作者：南京兔牙生物科技有限公司浏览：666

游离DNA提取方法

【操作方法-离心法】

使用前先在Buffer W1和Buffer W2中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1. 加1.44 mL Buffer L1至5 mL离心管中，并加入40 µL蛋白酶K。
2. 加入1.8 mL血浆或尿液样本，盖上管盖，旋涡振荡30秒，60℃孵育30min。
*如果尿液 体积不足1.8 mL mL，则必须补加生理盐水使尿液体积达到1 mL。
3. 加入1 mL 异丙醇，颠倒混匀离心管3－5次，-20℃保存5-10min。
4. 将步骤3中的上清液倒入到核酸纯化柱中（核酸纯化柱置于2mL 离心管中），盖上管盖，12000 rpm 离心30秒，若体积过多，一次过滤不完，可重复该步骤，直至步骤3中溶液完全过完纯化柱（不用更换过滤柱）。
5. 弃除滤液，将核酸纯化柱置回到2mL 离心管中，在核酸纯化柱中加入500 µL Buffer W1, 盖上管盖，12000 rpm 离心30秒。
* 确认在Buffer W1 中已经加入无水乙醇。
* 滤液无须彻底弃尽，如果要避免粘附在离心管管口的滤液对离心机的污染，可将2mL 离心管在纸巾上倒扣拍击一次。
6. 弃2mL 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL 离心管中，在核酸纯化柱中加入500 µL Buffer W2, 盖上管盖，12000 rpm 离心30秒。
* 确认在Buffer W2中已经加入无水乙醇。
7. 弃2mL 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL 离心管中，在核酸纯化柱中加入500 µL无水乙醇, 盖上管盖，12000 rpm 离心1分钟。
8. 弃2mL 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL 离心管中，14000 rpm 离心3分钟。
* 如果离心机的离心速度达不到14000 rpm，则用较高速离心4分钟。
* 请勿省略该步骤，否则可能因所纯化的核酸中混有乙醇而影响后续的PCR效果。
7. 弃2mL 离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 mL 离心管中，在纯化柱中加入50-100 µL 60℃温育的Buffer TE或水，盖上管盖，室温静置3分钟，12000 rpm 离心1秒。
* 如果离心机没有防泄漏的盖子，请将离心条件改为8000 rpm离心1分钟，以免管盖脱落而损伤离心机。
8. 弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验，或者将DNA储存于-20℃备用。


【操作方法-真空抽滤法】
使用前先在Buffer W1和Buffer W2中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1. 加1.44 mL Buffer L1至5 mL离心管中，并加入40 µL蛋白酶K。
2. 加入1.8 mL血浆或尿液样本，盖上管盖，旋涡振荡30秒，60℃孵育30min。
*如果样本体积不足1.8 mL mL，则必须补加生理盐水使样本体积达到1.8 mL。
3. 加入1 mL 异丙醇，颠倒混匀离心管3－5次，-20℃保存5-10min。
4. 将过滤柱插入到真空泵系统的上，在过滤柱上放置20 ml的扩容管。
*保证补充管完全插入到过滤柱上，避免样品漏出。
5、小心地将第3步得到的裂解液的混合液加入到在过滤柱上的扩容管中，打开真空泵。当所有的裂解液完全通过柱子后，小心取下补充管，丢弃。
*为了避免交叉污染，在相邻的过滤柱间移动时务必小心操作。
6. 将500 µL Buffer W1加入到过滤柱中，保持柱子是打开状态，在所有的Buffer W1完全通过了过滤柱后。
7. 将500 µL Buffer W2加入到过滤柱中，保持柱子是打开状态。在所有的Buffer W2完全通过了过滤柱后。
8. 将500 µL的乙醇(96–**) 加入到过滤柱中，保持柱子是打开状态。在所有的乙醇完全通过了过滤柱后，关掉真空泵。
9. 关闭上过滤柱，从真空泵上取下。将过滤柱放置在一个干净的 1.5 ml收集管中，全速(20,000 x g; 14,000 rpm)离心3 min。
10. 将过滤柱置于一个1.5 ml收集管中，打开盖子，室温干燥2-3分钟。
11. 小心地将50–100 µL的Buffer TE或水加入到过滤柱膜*，盖上盖子，室温孵育3 min。
注意：保证Buffer TE或水已经平衡至室温(15–25°C)。如果洗脱液体积比较小(<50 μl)，那么应该将洗脱液加入到膜*，保证能完全洗脱结合的DNA。洗脱体积是可以根据下游的不同应用进行调整的。
12. 全速(20,000 x g; 14,000 rpm)离心1 min，洗脱核酸。


我们有*的游离DNA提取试剂盒，能对血液或者尿液中的游离DNA进行高效提取，阳性样本小片段DNA（170bp左右）回收率测试在90%以上，每毫升血浆cfDNA得率为30-40ng，尿液20ng。由于在学校的课题涉及该方面，因此，通过该试剂盒对血浆或尿液样本的抽提次数**过千次，抽提效果稳定。可满足离心机或真空泵的提取。仅用于科研。提供相应的配套耗材。若有需要，可以留言联系。

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