FFPE样本核酸的提取

时间：2022-07-04作者：南京兔牙生物科技有限公司浏览：231

     01 样本切片     

     石蜡样本在提取前需要进行切片处理，一般需要5-6个切片，一片镜检确定**细胞含量，其他进行后续提取处理。切片的薄厚程度对后续观察和提取会有一定影响。切片过厚不利于后续染色和组织学观察，而且组织脱蜡和蛋白酶消化困难增加；切片过薄易造成DNA的机械损伤，同时切片总面积的增加，其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多。

      为了避免FFPE样品分子分析的问题，样品染色应尽可能避免。某些染料和试剂可能对核酸造成不利影响，特别是那些用于*组化染色的试剂。涉及高pH和重金属离子的染色步骤应当避免。如果样品染色是必需的，则可以选择甲酚紫（cresyl violet），因为它与核酸分析兼容。




      02 样本脱蜡
      为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底的脱蜡。在此过程中，先溶解石蜡，然后去除，暴露样品，用于后续裂解缓冲液和蛋白酶K（如果合适）的处理。多种溶剂适用于脱蜡，如二甲苯、庚烷和柠檬烯等。二甲苯脱蜡不仅容易造成核酸片段化和得率低，而且对人有毒害，切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。作为溶剂法的替代，石蜡也可通过加热与FFPE样品分离：熔化后，石蜡冷却，取决于其用量，石蜡粘在管壁上，或在样品上形成一个固体层。
市面上主流试剂盒是采用无毒裂解液方法脱蜡，以及Covaris的超声乳化脱蜡，纳米级别的处理使得FFPE样品彻底脱蜡和水化。
Covaris采用高频率短波长的医用级别超声波，仪器与样本不进行接触，球型换能器产生超声聚焦作用于样本，能量利用率较高，方向和力度精准可控，处理重复性好。




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• 词条

  词条说明

• 游离DNA提取

  游离DNA提取方法【操作方法-离心法】使用前先在Buffer W1和Buffer W2中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。1. 加1.44 mL Buffer L1至5 mL离心管中，并加入40 µL蛋白酶K。2. 加入1.8 mL血浆或尿液样本，盖上管盖，旋涡振荡30秒，60℃孵育30min。*如果尿液 体积不足1.8 mL mL，则必须补加生理盐水使尿液体积达到1 mL。3. 加入1 m

• 游离DNA提取

  原理：1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度较低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。准

• Qubit定量技术原理

  Qubit 3.0荧光定量仪技术原理：Qubit 3.0荧光定量仪结合Qubit定量试剂盒，采用专门研制的荧光染料，对生物分子进行精确定量，包括DNA，RNA，和ProteinQubit 3.0荧光定量仪特定荧光染料选择性地特异性靶 分子结合，发射荧光信号1、荧光染料不会接结合杂质，如游离核苷酸2、基于荧光检测技术，**传统紫外光分光光度法三个数量级3、较少仅需1ul的样品4、可检测低浓度样品（1

• FFPE提取 FFPE样本DNA提取

  FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding）样本是医学领域常见的生物材料。此类样本已经被广泛应用于高通量测序、原位杂交、*组织化学等研究领域。目前据估计，**约有数十亿FFPE组织样本保存在医院或者组织样品库中，这些组织样本是疾病诊断和科学研究的较为宝贵的的生物学资源之一。FFPE样本随着基因组学检测技术的快速发展，尤其新一代测序技术（NGS）的飞速发展，在细胞